Extracción de ADN

La extracción de ácido desoxirribonucleico (ADN) es el proceso mediante el cual el ADN se separa de las proteínas, las membranas y otros materiales celulares contenidos en la célula de la cual se recupera. El proceso de extracción de ADN requiere un manejo cuidadoso del material biológico para evitar la contaminación de la muestra y el cruce.

Debido a la estructura lipídica de la membrana celular, la presencia de proteasas, magnesio y el enrollamiento del ADN alrededor de las histonas; muchos de los procedimientos de extracción de ADN disponibles tienen elementos comunes. La extracción de ADN generalmente sigue tres pasos básicos:

1. Lisis (romper) abrir las células.

2.Separar el ADN de los otros componentes celulares.

3.Aislar el ADN.

La membrana celular se rompe por cualquiera de los siguientes métodos: uso de calor para aumentar la fluidez, ditiotreitol (DTT) para reducir los enlaces disulfuro o un detergente, como el dodecilsulfato de sodio (SDS), para romper la membrana. Las proteínas, incluidas las nucleasas, se inactivan por desnaturalización por calor o por enzimas digestivas, incluida la proteinasa K, para cortarlas. La temperatura debe mantenerse por debajo de 60 °C y el período debe ser lo suficientemente corto (15 a 20 minutos) si se requiere un ADN no degradado de alto peso molecular. El magnesio necesario para la actividad de la nucleasa o el ADN se inmoviliza en una fase sólida y se eluye con tampón / sal. Si el ADN permanece en la fase acuosa, se separa de los otros materiales celulares, incluidas las proteínas y los lípidos, centrifugando este último al fondo del tubo o repartiéndolos en disolventes orgánicos.

Hay cuatro procedimientos de extracción comúnmente utilizados para la extracción de ADN ( Hoff-Olsen et al., 1999 ):

1.Orgánico (variaciones de fenol / cloroformo): uso de un proceso químico líquido de múltiples etapas que requiere mucha mano de obra pero produce una muestra de ADN extraído de doble cadena muy limpia y de alto rendimiento.

2.Métodos inorgánicos de Chelex o sílice: proceso simple y barato de extracción en un tubo en el que el Mg 2+ se une a las perlas de resina y produce un producto de ADN de cadena sencilla.

3.Métodos de extracción en fase sólida (por ejemplo, DNA IQ de Promega  (Eminovic et al., 2005, manual de DNA IQ ), PrepFiler de Applied Biosystems ( Brevnov et al., 2009, manual de PrepFiler), y Kits QIAamp de Qiagen (Castella et al., 2006, Greenspoon et al., 1998)): proceso de extracción simple en el que el ADN se une a perlas paramagnéticas o de sílice.

4.Extracción diferencial: un proceso de varios pasos que se utiliza para separar el esperma de otras células mediante la TDT; utilizado para analizar pruebas biológicas de casos de agresión sexual ( Drobnic, 2003 ).

Elegir un método de extracción adecuado es vital importancia en los análisis moleculares. Esto dependerá del organismo que quiera estudiar, el tejido disponible y su estado de conservación, la técnica que se aplicará posteriormente, así como la infraestructura de los laboratorios, los recursos económicos y tiempo para obtener resultados (Alejo et al., 2014).

Una vez realizada la extracción de ADN es necesario cuantificarlo así como analizar su calidad. Uno de los métodos más utilizados para la cuantificación del ADN es el análisis de la absorción UV, ya que los nucleótidos poseen máximos de absorción alrededor de 260 nm (por ejemplo, dATP: 259 nm; dCTP: 272 nm; dTTP: 247 nm). Este método proporciona una estimación simple y precisa de la concentración de una muestra, pero sólo si ésta se encuentra pura, sin contaminación significativa de proteínas o solventes orgánicos que absorben a longitudes de onda cercanas. Para evaluar la pureza de la muestra debe determinarse la proporción OD 260nm/OD 280nm. Si la relación es mayor a 1,6 puede estimarse que la muestra es lo bastante pura para confiar en la cuantificación espectrofotométrica. La calidad de las moléculas extraídas se analizan por electroforesis en gel de agarosa, si las bandas son solidas y de alta visibilidad el ADN cuenta con una alta calidad.